секвенирование следующего поколения что
Применение секвенирования нового поколения
Существует множество платформ использующих различные технологии секвенирования, подробное обсуждение которых выходит за рамки этой статьи. Однако на всех платформах NGS параллельно выполняется чтение последовательности миллионов мелких фрагментов ДНК. Биоинформатический анализ используется для объединения этих фрагментов путем сопоставления отдельных данных с эталонным геномом. Каждый из трех миллиардов оснований в геноме человека секвенирован несколько раз. NGS можно использовать для решения последовательности целых геномов или с ограничениями по конкретным областям, включая все 22 000 кодирующих генов (экзом) или небольшое количество отдельных генов.
Возможности использования NGS в клинических исследованиях.
Клиническая генетика
Существует множество возможностей использовать NGS в клинической практике для улучшения диагностики и процесса лечения пациента, в том числе:
Спектр изменения ДНК в геноме человека включает небольшие изменения (замены), вставки и делеции, большие геномные делеции экзонов или целых генов и перегруппировки, такие как инверсии и транслокации. Традиционное определение по Сэнгеру ограничивается открытием замещений и небольших вставок и делеций. Для оставшихся мутаций часто проводятся специализированные анализы, такие как гибридизация флуоресценции in situ (FISH) для обычных кариотипов или микромассивов сравнительной геномной гибридизации (CGH) для обнаружения изменений субмикроскопических хромосомных копий, таких как микроделеции. Однако эти данные также могут быть получены из данных секвенирования NGS напрямую, что устраняет необходимость в специализированных анализах при сборе полного спектра геномных изменений в одном эксперименте. Ограничения находятся в районах, которые ошибочно отображаются из-за выского содержания гуанина/цитозина (GC) или повторяющейся архитектуры, например, повторных экспансий, связанных с болезнью Хантингтона.
NGS позволяет исследовать последовательность без предсказания и начальных данных
Капиллярное секвенирование зависит от предсказания последовательности исследуемого гена или локуса. Однако NGS совершенно неселективна и используется для решения последовательности полных геномов или экзомов, чтобы обнаружить совершенно новые мутации и гены, вызывающие болезни. В педиатрии это можно было бы использовать, чтобы разгадать генетическую основу необъяснимых синдромов. Например, общенациональный проект «Расшифровка нарушений развития», работающий в Институте Wellcome Trust Sanger в сотрудничестве с клиническими генетическими службами NHS, направлен на распутывание генетической основы необъяснимой задержки развития путем секвенирования геномов детей и их родителей, чтобы выявить вредные варианты de novo. Объединение этих молекулярных данных с подробной клинической фенотипической информацией было успешным в выявлении новых генов, мутировавших у пораженных детей с аналогичными клиническими признаками.
Повышенная чувствительность NGS позволяет обнаруживать мозаичные мутации
Мозаичные мутации приобретаются как событие происходящее после оплодотворения, и, следовательно, они присутствуют с переменной частотой в клетках и тканях человека. Капиллярное упорядочение может пропустить эти варианты, поскольку они часто присутствуют в количестве, которое находится ниже порога чувствительности технологии. Секвенирование NGS обеспечивает гораздо более чувствительное считывание и поэтому может использоваться для идентификации вариантов, которые находятся всего в нескольких процентах клеток, включая изменение мозаики. Кроме того, чувствительность секвенирования NGS может быть дополнительно увеличена путем увеличения глубины секвенирования. Это показало, что NGS применяли для очень чувствительных исследований, таких как считывание фетальной ДНК из материнской крови или отслеживание уровней опухолевых клеток в крови больных раком.
Микробиология
Основной полезностью NGS в микробиологии является замена традиционной характеристики патогенов морфологией, свойствами окрашивания и метаболическими критериями с геномным определением патогенов. Геномы патогенов показывают, что они собой представляют, могут содержать информацию о чувствительности к лекарственным средствам и сообщать о взаимосвязи разных патогенов друг с другом, которые могут использоваться для отслеживания источников вспышек инфекции. NGS использовалось для выявления и отслеживания вспышки устойчивой к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) в отделении интенсивной терапии новорожденных в Великобритании. Что наиболее примечательно, так это то, что рутинное микробиологическое наблюдение не показало, что случаи MRSA, которые произошли в течение нескольких месяцев, были связаны. Однако NGS патогенов позволили точно определить изоляты MRSA и выявили затяжную вспышку
Онкология
Основополагающей предпосылкой геномики рака является то, что рак вызван соматически приобретенными мутациями, и, следовательно, он является заболеванием генома. Хотя капиллярное секвенирование используется уже более десятилетия, эти исследования были ограничены относительно небольшим количеством образцов и небольшим количеством генов-кандидатов. С появлением NGS, геномы раковых клеток теперь могут быть изучены полностью. Для ребенка, страдающего от рака, это может обеспечить многие преимущества, в том числе более точный диагноз и классификация заболевания, более точный прогноз и, возможно, выявление причинно-следственных мутаций. Таким образом, индивидуальное планирование может стать основой персонализированного лечения рака. В настоящее время существуют экспериментальные проекты с использованием NGS в клинической практике, главным образом для выявления мутаций в опухолях, которые могут быть использованы для получения мутационных препараты.
Ограничения метода
Основным недостатком NGS в клинических условиях является создание необходимой инфраструктуры, такой как компьютерная емкость и хранение, а также кадровый опыт, необходимый для всестороннего анализа и интерпретации последующих данных. Кроме того, объем данных должен использоваться умело, чтобы извлечь клинически важную. Фактическая себестоимость NGS незначительна. Однако, чтобы сделать NGS экономически эффективным, пришлось бы запускать анализ большого количества образцов, которые могут потребовать сложной централизации. После первоначальных капиталовложений NGS может предоставлять услуги в национальном масштабе, которые, вероятно, будут экономически выгодны в дополнение к улучшению лечения пациентов.
Компания Пущинские лаборатории предлагает оборудование для секвенирования производства Thermo Fisher Scientific. Мы всегда готовы проконсультировать вас по данному оборудованию, а также оказать техническую и методическую поддержку
Статья «Технологии секвенирования второго поколения»
Технологии секвенирования. Второе поколение NGS . Платформа 454 Sequensing (« Roche »)
1. Технология секвенирования
Общий принцип пробоподготовки для большинства современных (NGS) секвенаторов включает фрагментирование ДНК, привязку к субстрату, амплификацию фрагментов с помощью ПЦР и последующее считывании последовательности НК. В отличие от метода секвенирования по Сэнгеру, современные платформы обеспечивают параллельное проведение миллиардов реакций в малых объемах, что позволяет получить намного больший объем информации на выходе.
Мы расскажем о методе Roche 454.
2. Принцип секвенирования
Готовые ДНК-библиотеки иммобилизуют на магнитных сферах. Затем магнитные сферы с нанесенной на них клональной библиотекой доставляют на проточную ячейку, где в присутствии праймера, дезоксинуклеотидтрифосфатов и ферментов — ДНК-полимеразы, люциферазы, АТФ-сульфурилазы — происходит циклический синтез новой цепи.
Во время цикла пиросеквенирования при образовании фосфодиэфирной связи между матричной цепочкой ДНК и нуклеотидом синтезируемой цепи выделяется пирофосфат, который запускает каскад химических реакций, приводящих к выделению АТФ, необходимой для реакции окисления люциферина с выделением кванта света, который фиксируют аналоговой интегральной микросхемой (ПЗС-матрицей), состоящей из светочувствительных фотодиодов. Нуклеотиды, не вовлеченные в синтез новой цепи, удаляют из проточной ячейки, и начинается следующий реакционный цикл, в ходе которого добавляют дезоксинуклеотидтрифосфат другого типа.
ДНК фрагментируют и лигируют к фрагментам адаптеры
Фрагмент закрепляется на микро-шарике, покрытой олигонуклеотидами, комплементарными концам адаптера
Шарики с ДНК смешивают с эмульсией, содержащей ДНКполимеразу и dNTP и проводят ПЦР
Носитель – плашка с множеством (> 1 000 000) лунок
В лунки загружаются шарики, на которых закреплены фрагменты ДНК
Также в лунки помещаются частицы с закрепленными на них ферментами – АТФсульфурилазой и люциферазой
Через лунки в заданном порядке пропускают реагенты (dNTP, люциферин, аденозинфосфосульфат)
При присоединении dNTP выделяется пирофосфат. Сульфурилаза преобразует пирофосфат + аденозинфосфосульфат в АТФ. АТФ используется для окисления люциферина люциферазой. Световой сигнал регистрируется фотокамерой
цена за запуск — 1100 — 6200 долларов
цена за Мб данных — от 7 до 22 долларов
Типы секвениторов с илл
Пиросеквенирование от «Диаэм»
Принцип пиросеквенирования используется в секвенаторе PyroMark Q24, производимом компанией Qiagen. Этот прибор предназначен для одновременного прочтения 24 коротких последовательностей (до 100 нуклеотидов) и широко применяется в научных исследованиях и диагностике для точечного генотипирования и анализа метилирования. Основное достоинство секвенатора PyroMark — высокая точность и возможность анализа практически любого точечного полиморфизма.
Преимущества и недостатки
• большая длина чтения (сравнимо с секвенированием по Сэнгеру)
• короткое время работы
• наименее чувствительна к GC-составу
• неточность прочтения гомополимерных участков
• высокая цена в расчете на нуклеотид
• в 2016 году прекратилась поддержка, в настоящий момент не используется
Секвенирование следующего поколения (NGS)
Секвенаторы на платформе Ion Torrent делают высокопроизводительное секвенирование простым, быстрым и доступным — секвенируете ли вы панели генов, транскриптомы, экзомы или геномы.
Почти половина NGS-исследований на сегодняшний день связана именно с целевым секвенированием. Такой дизайн эксперимента позволяет считывать не весь геном/транскриптом, а только те его фрагменты, которые необходимы для последующего анализа. Можно использовать десятки генных панелей для исследования наследственных заболеваний, различных видов рака, экспрессии генов. Панели хорошо зарекомендовали себя в ведущих лабораториях, специализирующихся на научных исследованиях и в медицинской генетике.
Секвенирование «клинического» экзома – секвенирование экзонов только тех генов, мутации в которых, приводят к развитию известных заболеваний. На сегодня в базе OMIM описано более 4700 таких генов.
Основное преимущество экзомного секвенирования в том, что оно позволяет проводить массовый скрининг генов и обнаруживать мутации в белок-кодирующих последовательностях, ассоциированные с заболеваниями, но при этом проще и дешевле, чем полногеномное секвенирование.
Метод секвенирования РНК становится основным методом определения того, какие гены и на каком уровне экспрессируются в клетке. С помощью РНК секвенирования можно определять различия в экспрессии генов на различных стадиях развития организма или в разных тканях. Также можно определить транскрипция каких генов изменяется при развитии болезней и рака. В связи с удешевлением методов секвенирования нового поколения появилась возможность определять экспрессию генов у любого человека для диагностики заболеваний.
Анализ копийности генов (CNV) и определение анеуплоидий, анализ мутаций и копийности генов парафинизированных (FFPE) образцов, выявление специфичных для опухолей генетических перестроек, изучение полномасштабных профилей экспрессии генов, исследование известных мутации, связанных с метаболизмом лекарств, проверка наличия каузативных мутаций для исследований специфических путей развития заболеваний, выявление мутаций, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам, идентификация видов бактерий в смешанных образцах и др.
КЛИНИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Самый современный метод диагностики наследственных заболеваний.
Точные методы диагностики:
Что такое секвенирование
Секвенирование — это метод определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК. Тестирование используется для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностей организма. Существует несколько разновидностей секвенирования, которые позволяют выявлять возможные генетические отклонения и редкие генетические варианты, тонко влияющие на появление определенных патологий в человеческом организме.
Показания к проведению анализа с помощью метода секвенирования:
Для получения более подробной информации об исследовании вы можете позвонить по телефону:
либо воспользоваться консультацией врача-генетика
Основные этапы исследованияя
Вне зависимости от типа секвенирования процедура делится на несколько основных этапов:
Таргетное секвенирование
Возможности таргетного секвенирования
Метод таргетного секвенирования позволяет выделять и исследовать конкретные области геномов или отдельные гены. Технологии нового поколения позволяют рассчитывать время и затраты на исследование. Таргетному анализу могут подвергаться отдельные интересующие пациента гены, участки генов и митохондриальные ДНК.
Преимущества таргетного секвенирования
По сравнению с комплексными методами анализа таргетное секвенирование более выгодно. Исследуются лишь отдельные участки генов, в которых могут определяться мутации. В таком случае для диагностики требуется меньше ресурсов, поэтому таргетный поиск отдельных отклонений обойдётся гораздо дешевле, нежели полная диагностика.
Панели генов
Таргетные панели были разработаны в отношении групп заболеваний, объединенных какими-то общими симптомами, например, аутизм, задержка психического развития, онкологические заболевания и т.д. К примеру, если в истории семьи обнаруживаются признаки одного или нескольких различных наследственных опухолевых заболеваний, то семья вполне может быть носителем опухолевого наследственного заболевания. Панель “наследственный рак” объединяет серию генетических мутаций, которые могут приводить к наследственному раку. В некоторых случаях наиболее эффективной может оказаться первоначальная проверка при помощи таргетных панелей нового поколения, таких как CancerNext, с целью добиться полного покрытия задействованных генов.
Мультигенные панели
Группа исследований, предназначенных для диагностики клинически сходных заболеваний. Такие исследования могут включать от 10 до 600 генов. Они могут быть эффективны для уточнения диагноза, дифференциальной диагностики и поиска патогенных мутаций.
Полногеномный анализ
Полногеномное секвенирование дает максимально полный набор данных о структуре генетического материала и позволяет детально оценить все индивидуальные генетические вариации. Секвенатор нового поколения IlluminaNextSeq 500 может определять полную структуру генома человека за 2 дня. Каждый участок генома при этом прочитывается 30 раз для повышения точности полученных данных.
Достоверность диагностики при выборе данного вида анализа повышается, если обследовать всю семью: ребенка и родителей.
Что можно получить при полногеномном секвенировании?
Этот метод позволяет обнаружить целый ряд отклонений.
Когда нужно делать секвенирование генома?
Секвенирование генома проводится в следующих случаях.
Анализ данных
В результате полногеномного секвенирования получается огромный объем данных, который требует специальной обработки. Такая обработка включает несколько этапов.
Секвенирование экзома
Секвенирование экзома – это тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностей организма.
Некоторые нуклеотиды исчезают или наоборот удваиваются или заменяются. Во многих случаях это ведет к неправильному формированию организма. Это может проявляться в виде врожденных пороков или малых аномалий развития, задержке психического развития, аутизме и других формах отклонений.
Ученые считают, что полное секвенирование экзома поможет не только обнаружить болезнь, но и предсказать ход прогрессирования заболевания и вовремя начать необходимое лечение. Выявление наследуемых мутаций также важно для оценки репродуктивных рисков.
Клиническое секвенирование экзома
Полное секвенирование экзома
Этот тест включает в себя глубокий анализ 4800 клинически значимых генов, которые связаны с известными наследственными заболеваниями. Наличие обнаруженных мутаций подтверждается классическим секвенированием по Сэнгеру. При необходимости проводится поиск аналогичных мутаций у родителей.
Цель теста – исследование экзома конкретного пациента. Метод клинического секвенирования экзома подходит для обнаружения точечных мутаций, вставок, делеций, инверсий и перестановок в экзоме. Пациент получает заключение об изменениях, связанных с его заболеванием. В то же время лечащий врач может дополнительно запросить более подробную информацию, включая данные о потенциально патогенных вариантах, локализованных в хорошо изученных областях экзома.
Результаты анализируются и проверяются целой командой специалистов медиков. Отчет об обнаруженных изменениях сопровождается подробными комментариями.
Перед проведением тестирования рекомендуется дополнительная консультация врача-генетика. В таком случае пациент может убедиться в необходимости прохождения того или иного набора тестов. Также в ходе консультации рассказывается о возможных преимуществах и рисках генетического тестирования. Дело в том, что потенциальную опасность может представлять не само тестирование (оно совершенно безвредно для пациента), а информация об обнаруженных в генетическом материале отклонениях. В частности, сведения о врожденной предрасположенности к тому или иному заболеванию обычно не сообщаются лицам, не достигшим совершеннолетия. Каждая лаборатория вырабатывает свою политику поведения в подобных случаях.
Преимущества
Ход анализа
В качестве образца для анализа сдается около 10 мл крови.
Часто задаваемые вопросы
Что включает клиническое секвенирование экзома?
Клиническое секвенирование экзома разделяется на несколько этапов.
Секвенирование: Диагностическое секвенирование экзома (DES) включает секвенирование примерно 20 000 генов. Это отличает его от секвенирования всего генома, поскольку метода нацелен на исследование 1-2% областей генома, кодирующих синтез белков, которые предположительно ответственны за появление примерно 85% от числа известных заболеваний. Целью DES является выявление изменений, которые определяют фенотип пациента.
Анализ и проверка: после завершения секвенирования все полученные данные пропускаются через биоинформационный конвейер и последовательно анализируются коллективом медиков. Для каждой обнаруженной альтерации проводится проверка, является ли она связанной с исследуемыми особенностями фенотипа. Потенциально связанные альтерации отправляются на ко-сегрегационный анализ.
Формирование отчета: каждый отдельный случай проходит несколько уровней медицинской проверки, и только после последней из них формируется отчет. Каждый отчет является специфическим для пробанда (человека, генетика которого исследуется) и включает проверку и анализ в том числе литературных данных. Подготовка отчета может длиться от нескольких дней до нескольких недель в зависимости от сложности исследования.
Доступные варианты секвенирования экзома:
Первый уровень (Клиническое секвенирования): Анализ примерно 4 800 клинически охарактеризованных генов. Полное секвенирование экзома пробанда. Проведение ко-сегрегационного анализа семьи для всех положительных или неоднозначных результатов.
Второй уровень (Полное секвенирование экзома): Анализ всех предоставленных генов с целью проведения поиска новых генов (порядка 20 000 генов по всей базе NCBI RefSeq). Полное секвенирование экзома семейного трио. Семейный ко-сегрегационный анализ для обнаруженных позитивных или неоднозначных результатов. Обязательное требование: минимум три образца от членов семьи. Тестирование на образцах эмбрионов не проводится.
Какие данные входят в отчет?
Общие результаты: положительный, предположительно положительный, отрицательный, неоднозначный.
Первичные сведения могут ограничиваться информацией, напрямую связанной с фенотипом. Это помогает выделить наиболее полезную для диагностики болезни информацию. Дополнительные сведения чаще содержат более подробные данные, относящиеся к экзому в целом, безотносительно связи с фенотипом.
Дополнительные сведения: Они варьируются в зависимости от предпочтений и возраста пациента. Данный отчет обсуждается отдельно. В дополнительные сведения попадают только установленные патогенетические или предположительно патогенетические альтерации. О клинически незначимых и доброкачественных альтерациях не сообщается. Дополнительные сведения передаются только пробанду. Прочие члены семьи не получают отчета с дополнительной информацией, однако носительство может быть предположено на основании результатов пробанда.
Когда следует заказывать таргетное секвенирование (целевая панель генов) вместо полного сквенирования экзома?
Перед тем, как начать клиническое секвенирования экзома, важно определить возможность использования таргетных панелей, которые разработаны в отношении некоторой группы заболеваний, например, аутизм, задержка психического развития и пр. К примеру, если в истории семьи обнаруживаются признаки одного или нескольких различных наследственных опухолевых заболеваний, то семья вполне может быть носителем опухолевого наследственного заболевания.
В таком случае более эффективным подходом может оказаться первоначальная проверка при помощи таргетных панелей нового поколения, таких как CancerNext, с целью добиться полного покрытия задействованных генов, поскольку такая проверка позволяет получить в том числе полностью отрицательный результат и исключить наличие мутаций в основных опухолевых генах.
Можно ли комбинировать секвенирование экзома с проведением иных генетических тестов (к примеру, хромосомным микроматричным анализом) в рамках одного заказа?
Мы рекомендуем вначале делать хромосомный микроматричный анализ, а затем выполнять секвенирование экзома.
Что необходимо предоставить для клинического секвенирование экзома?
Для выполнения секвенирования экзома необходимы:
Принимаются ли для тестирования материалы только пробанда, когда образцы родителей или иных родственников первой степени предоставить невозможно (к примеру, для приемных детей)?
Если для тестирования предоставляются только образцы пробанда либо предоставляется менее трех образцов от родственников первой степени, то можно заказать лишь проведение тестирования первого уровня (FTE).
Есть ли у клинического секвенирования экзома технические ограничения?
Да, ограничения существуют.
Можно ли сделать повторный анализ данных, полученных при секвенировании?
Да, мы предоставляем такую возможность.
Повторный анализ данных без взимания дополнительной платы возможен в течение двух лет после получения образцов.
Можно ли провести полное секвенирование экзома для эмбриональных образцов?
Эмбриональные образцы принимаются только в случае гибели плода. Для эмбриональных образцов доступно тестирование первого уровня (FTE).
Если вариант ДНК был пересмотрен и классифицирован иначе, получит ли врач уведомление об этом, чтобы сообщить обновленную информацию своему пациенту?
Секвенирование экзома в нашей лаборатории предполагает повторную классификацию вариантов. Получение дополнительной информации основанной на больших популяционных исследованиях помогает облегчить интерпретацию и уточнить диагноз. Наша лаборатория, как и все научное сообщество вовлечены в активную работу с целью лучшего понимания человеческого генома. Интерпретации и методы постоянно совершенствуются.
Проверяются ли новые гены?
Новые гены анализируются при условии выбора DES тестирования (клиническая диагностика экзома). Под новыми генами подразумеваются альтерации в генах, которые ранее не связывались с болезнями. В связи со сложностью анализа новых генов, клиническая диагностика экзома (DES) требует больше времени для выполнения заказа по сравнению с тестированием первого уровня экзома (FTE).
Если альтерации в новых генах уже обнаружены и описаны, все усилия направляются на изучение гена, включая координационные исследования и функциональные исследования с группами исследователей, изучающих ген, при наличии таковой возможности.
Предоставляет ли лаборатория полный список вариантов по пациенту?
Да, список предоставляется.
Примечание: не все альтерации из списка вариантов проходят подтверждение другими методами, и потому эти данные должны использоваться лишь в исследовательских целях.
Включает ли проводимое тестирование секвенирование митохондриального генома?
Если было обнаружено, что пациент является носителем мутации (или мутаций), можно ли протестировать членов его семьи?
Да, для членов семьи пациента можно провести односайтовый анализ альтераций, классифицированных как причины болезни.
Родственники первой степени и прочие родственники с тем же фенотипом проверяются в рамках ко-сегрегационного анализа, если соответствующие образцы были получены вместе с образцами пробанда для тестирования.
Биоинформатический анализ экспертного уровня:
Возможен анализ данных, предоставляемых заказчиком. Для уточнения информации свяжитесь с врачом-генетиком.
Биоинформационный анализ включает: